Make your own free website on Tripod.com

 

 

Анализ гетерогенности популяции ольхи (Alnus Mill., Betulaceae) севера Европейской части России

 

Ильинский В.В.†1, Ребриков Д.В. ‡

 

Московская гимназия на Юго-западе N 1543. 117571, Москва, ул. 26 Бакинских Комиссаров, д. 3, корп. 5;

ЗАО "НПФ ДНК-Технология" 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24, к. 2,

 

Ключевые слова: однонуклеотидные полиморфизмы, Alnus, Betulaceae, ITS, рРНК

 

Аннотация

С целью исследования гетерогенности популяции ольхи на территории Российской Федерации с целю выявлении эндемичных видов, был проведен анализ нуклеотидной последовательности участка рРНК и морфометрический анализ листовой пластинки у представителей рода Alnus Miller: Alnus incana (L.) Moench., Alnus glutinosa (L.) Gaertn., Alnus kolaёnsis Orlova и Alnus x pubescens Tausch. Проведенные генетические и морфометрические исследования говорят в пользу придания Alnus kolaёnsis таксономического статуса вида. В исследовании были обнаружены растения с гетерозиготным по участку рРНК генотипом, предположительно являющиеся гибридами Alnus incana х Alnus kolaёnsis.

 

Введение

Род Alnus Mill. включает по разным оценкам от 30 до 40 видов, распространенных в умеренных широтах Северного полушария (Комаров, 1936; Давидов, 1972; Furlow, 1979; Цвелев, 2004). Некоторые виды встречаются также в Южной Америке и Азии (где их ареал доходит до Бенгалии и Северного Вьетнама). В северном направлении отдельные виды доходят до лесотундры и тундры, а в горах поднимаются до субальпийского пояса.

Alnus incanaсамый распространенный вид ольхи Евразии. Хорошо известен полиморфизм Alnus incana, причем отдельные популяции настолько своеобразны, что некоторые авторы относят их к самостоятельным видам (например, Alnus kolaёnsis Orlova (Орлова, 1954), произрастающая на юго-востоке Фенноскандии, в Норвегии и на Кольском полуострове). Исследователи по-разному понимают таксономический статус кольской ольхи. Так, Н. И. Орлова (1954), М. Л. Раменская и В. Н. Андреева (1982) считают ее отдельным видом, А. К. Скворцов (1959) и O. Nilsson (2000) – подвидом A. incana, некоторые авторы предписывают ей статус экологической формы (Ильинский, Шипунов, 2005), а некоторые (например, Цвелев 2002, 2004) – предполагают гибридное происхождение A. kolaёnsis от скрещивания ольхи серой и клейкой (хотя в этом случае неясно отличие A. kolaёnsis от давно описанного гибрида A. x pubescens Taush). Многие авторы (Walters, 1993; Соколов, Филин, 1996) вовсе не выделяют этот таксон. Со своей стороны, O. Nilsson (2000) рассматривает A. x pubescens и A. kolaёnsis как отдельные формы. A. kolaёnsis имеет высокий прирост, не требовательна к почве, влажности, освещенности и имеет высокую скорость как семенного, так и вегетативного размножения (Давидов). Все это делает ольху ценной древесной породой, чья древесина может быть применена в различный отраслях промышленности. Однако ольха кольская занесена в красную книгу Мурманской области, что налагает запрет на ее вырубки. В связи с этим вполне предсказуемыми становятся попытки некоторых ученых понизить таксономический статус Кольской ольхи с целью разрешения на ее использование.

С целью прояснения сложившейся ситуации с таксономическим статусом A. kolaёnsis и A. x pubescens Taush и устранения существующих разночтений было решено провести генетическое и морфометрическое исследования четырех таксонов ольхи центрального и северо-западного регионов России: Alnus Miller: Alnus incana (L.) Moench., Alnus glutinosa (L.) Gaertn., Alnus kolaёnsis Orlova и Alnus x pubescens Tausch. Для всех таксонов был проведен анализ нуклеотидной последовательности участка рРНК и морфометрический анализ листовой пластинки.

Для сравнения нуклеотидных последовательностей был выбран внутренний транскрибируемый спейсер района рРНК (ITS1), к моменту начала исследования определенный для наибольшего числа представителей рода Alnus, в том числе и для рассматриваемых в данной работе Alnus incana и Alnus glutinosa. Данный район рРНК часто используется для построения филогенетических деревьев растений и является значимым аргументом при выделении новых видов (Navarro et. al., 2004). Поскольку последовательность ITS1 для Alnus kolaensis и Alnus x pubescens в открытых базах данных (например, NCBI, 2005) отсутствовала, мы определили последовательность участка ITS1 для этих таксонов, а также и для большой выборки Alnus incana и Alnus glutinosa.

Для морфометрического анализа были выбраны методики классической и геометрической морфометрии, поскольку сочетание этих методов позволяет получить наиболее полную картину сходств и различий между видами (Ильинский, Шипунов, 2005). Более того, геометрическая морфометрия хорошо зарекомендовала себя при анализе сложных групп, включающих таксоны гибридного происхождения (Jensen et al., 2002; Shipunov, Bateman, 2005)

 

Материалы и методы

Образцы

В исследовании был использован материал, предоставленный гербариями Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова (МГУ) (MW) и Биологического Института им. Комарова (БИН) РАН (LE), а также материал, собранный в ходе экспедиций биологического класса Московской гимназии 1543 в 2005 г. в Удомельском районе Тверской области. За истинную видовую принадлежность исследуемых образцов принимали данные гербария или результат определения по определителю И. А. Губанова и др. (2004) (для не гербарного материала).

 

Выделение ДНК и определение нуклеотидных последовательностей

Поскольку стандартные методики экстракции нуклеиновых кислот плохо подходили для работы с гербарным материалом, была использована оригинальная методика, комбинирующая классический метод ЦТАБ и метод сорбции на силикатных носителях.

Последовательность участка гена рРНК длиной 256 н.п. определяли по продукту ПЦР, полученному с использованием универсальных для семейства Betulaceae праймеров (Aln-d: 5'-GAACCTGCGGAAGGATCATTGTC-3' и Aln-r: 5'-CGTTGCCGAGAGTCGTTATGGT-3'). Определение проводили на аппарате ABI 3100 Avant и оригинальных реактивах и по методике рекомендованной производителем. Для каждого образца последовательность определяли для 2-х независимых ПЦР-продуктов, по обеим цепям каждый. Полученные последовательности ДНК были занесены в базу данных GenBank. Анализ нуклеотидных последовательностей и выбор праймеров производили при помощи программ DNASTAR 4.00 и Oligo 6.31. Для построения филогенетических деревьев использовали программу CLC Free WorkBench 2.01.

 

Морфометрический анализ

Морфометрический анализ листовой пластинки проводили при помощи методов геометрической и классической морфометрии, как это было описано ранее (Ильинский, Шипунов, 2005). В первом случае применялась методика с расстановкой 12 меток на концах жилок первого порядка.

Были проанализированы следующие природные и гербарные образцы: A. incana, A. x pubescens, A. kolaёnsis (= A. incana subsp. kolaёnsis (Orlova) A. Love et D. Love, = A. incana var. virescens Wahlenb.), A. glutinosa (только из центральной и северной России). Всего было проанализировано 82 образца.

 

Результаты

Анализ ДНК

Последовательность участка ITS была определена для 10 образцов Alnus kolaensis, 12 образцов Alnus x pubescens, 3 образцов Alnus incana и 4 образцов Alnus glutinosa.

Рис. 1. Кластер, построенный по методу NeighborJoin на основании новых данных (Alnus kolaensis, Alnus x pubescens) и данных GenBank. Цифрами показана длина ветвей. В качестве группы сравнения (outgroup) использовали представителей рода Betula.

 

Определенная последовательность для Alnus incana и Alnus glutinosa для всех образцов совпала с последовательностями из банка данных.

Последовательность для 7 образцов A. kolaensis была одинаковой и отличалась как от последовательности Alnus incana, так и от Alnus glutinosa (по одному отличающемуся нуклеотиду для каждого вида). Один образец, заявленный в гербарии как A. kolaensis представлял собой гетерозиготу по исследуемому участку, при этом один из аллелей соответствовал последовательности A. kolaensis, а другой – A. incana. По-видимому, этот образец является природным гибридом A. kolaensis х A incana. По последовательности исследованного участка рРНК был составлен кластер по методу NeighborJoin (Рис. 1). На схеме видно, что Alnus kolaensis ближе всего к А. incana.

 

Морфометрический анализ

Анализ главных компонент по методу классической морфологии показывает высокую полиморфность изученных групп ольхи по признакам листа. Тем не менее, на графике двух первых компонент (рис. 2) достаточно хорошо выделяются три «облака», соответствующие A. glutinosa, A. incana и A. kolaёnsis. Образцы A. pubescens также образуют отдельную группы. Предполагаемый гибрид A. kolaensis х A. incana, как видно из рисунка, занимает промежуточное положение между «облаками» A. incana, A. glutinosa и Akolaёnsis.

 

Рис. 2. График первой и второй компоненты, полученный на основании данных классической морфометрии. Буквами обозначены g – Alnus glutinosa, i – A. incana, k – A. kolaensis, буквой n отмечен образец, гетерозиготный по исследованному участку и предположительно являющийся гибридом A. kolaensis х A. incana.

При анализе данных при помощи метода геометрической морфометрии наиболее четкое распределение форм наблюдается на графике первой и третьей компонент (рис. 3). Образцы A.  kolaensis в значительной мере перекрываются с группой Aincana. Предполагаемый гибрид A. kolaensis х A. incana, так же, как и при классической морфометрии занимает центральное положение.

Рис. 3. График первой и третьей компоненты, полученный на основании данных геометрической морфометрии. Буквами обозначены g – Alnus glutinosa, i – A. incana, k – A. kolaensis, буквой n отмечен образец, гетерозиготный по исследованному участку и предположительно являющийся гибридом A. kolaensis х A. incana.

 

Выводы

Анализ ДНК

Из Рис. 1 видно, что A. kolaensis ближе всего к А. incana, а различия между ними сравнимы с различиями между Betula pendula и B. pubescens. Таким образом, Alnus kolaensis на основании анализа ДНК близка к A. incana, но имеет значимые отличия.

 

Морфометрический анализ

По данным классической морфометрии A. incana, A. glutinosa и Akolaёnsis образуют «облака», которые в равной степени перекрываются друг с другом, что свидетельствует в пользу таксономического статуса A. kolaёnsis как вида.

По результатам геометрической морфометрии «облака» A. incana, A. glutinosa и Akolaёnsis перекрываются еще больше, подтверждая высокую полиморфность рассмотренных видов ольхи по форме листьев. Однако, и здесь достоверно выделяющееся облако Akolaёnsis подтверждает значительное отличие данного таксона от других видов. Заметим, что выделение Кольской ольхи в самостоятельный вид производится Orlova с соавторами в основном по форме листовой пластинки.

 

Общие выводы

На основании полученных морфометрических и генетических данных A. kolaёnsis Orlova необходимо считать самостоятельным видом. В связи с этим была подтверждена необходимость охраны Кольского эндема.

Обнаруженный гетерозиготный образец, является, возможно, природным гибридом A. kolaensis х A. incana. Для этого образца характерны яйцевидные листья с тупой верхушкой 60 х 40 мм, семью жилками первого порядка, снизу по жилкам рассеянно опушенные. В связи с недостатком обнаруженного гибридного материала было решено не присваивать данному таксону видовой эпитет, однако обнаруженный гибрид требует более подробного изучения и, вероятно, нуждается в охране.

 

Благодарности

Я выражаю благодарность коллективу «НПФ ДНК-Технология» за предоставленные возможности. Я также признателен организаторам практик гимназии на Юго-западе 1543, сотрудникам гербария МГУ и БИН РАН за содействие в сборе материала.

Список литературы

 

Doyle JJ. & Doyle JL. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of

fresh leaf tissue. Phytochemistry Bulletin 19: 11-15.

Jensen RJ., Ciofani KM., Miramontes LC. 2002. Lines, outlines and landmarks: morphometric analysis of leaves of Acer rubrum, Acer saccharinum (Aceraceae) and their hybrid. Taxon 51, 475–492.

Navarro FB., Suarez-Santiago VN., Blanca G. 2004. A new species of Haplophyllum A. Juss. (Rutaceae) from the Iberian Peninsula: Evidence from morphological, karyological and molecular analyses. Annals of Botany 94: 571-582.

NCBI. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. 8th Dec. 2005

Nilsson O. 2000. Alnus Mill. In: Flora Nordica. Stokholm. Vol. 1.: 203−208.

R Development Core Team. 2004. R: A language and environment for statistical computing. Vienna: R Foundation for Statistical Computing.

Shipunov AB., Bateman RM. Geometric morphometrics as a tool for understanding Dactylorhiza (Orchidaceae) diversity in European Russia. Biol. J. Linn. Soc., in press.

Walters S.M. 1993. Alnus Mill. In: Flora Europea. 2nd ed. Cambridge. Vol. 1. 68−70.

Губанов ИА., Киселева КВ., Новиков ВС., Тихмиров ВН. 2004. Иллюстрированный определитель растений средней России. М: КМК-пресс.

Давидов МВ. 1972. Лесоводственно-биологическая характеристика ольхи // М., С. 4−13.

Ильинский ВВ., Шипунов АБ. 2005 Анализ изменчивости различных видов ольхи (Alnus Mill., Betulaceae) методами классической и геометричской морфометрии. Ботанический журнал 11: 1720-1733

Комаров В. Л. 1936. Род Ольха – Alnus Gaertn. // Флора СССР. М.;Л., С. 306−319.

Орлова Н. И. 1954. Новый вид ольхи с Кольского полуострова // Бот. мат. Герб. БИН. Т. 16. С. 70−75.

Раменская М. Л., Андреева В. Н. 1982. Alnus Mill. — Ольха // Определитель высших растений Мурманской области и Карелии. Л., С. 169−170.

Соколов Д. Д., Филин В. Р. 1996. Alnus Mill. — Ольха // Определитель сосудистых растений окрестностей ББС МГУ. М., С. 76.

Цвелев Н.Н. 2002. О родах Betula L. и Alnus Mill. (Betulaceae) в Восточной Европе. // Новости систематики высших растений. Т. 34. Спб., C. 47–70.

Подпись: 1 Corresponding author: phone/fax (+7910) 422 0657; e-mail: alnus_kolaensis@yahoo.co.uk