Make your own free website on Tripod.com

Московская гимназия на Юго-западе №1543

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Создание переносной автономной ПЦР-лаборатории и разработка ПЦР-тест-системы для быстрого различения видов ольхи Alnus incana (L.) Moench. и Alnus glutinosa (L.) Gaertn.

 

 

Практическая работа

 

 

Ученика 10 класса «Б»

Московской многопрофильной

гимназии на Юго-западе №1543

Ильинского В.В.

 

 

 

Научный руководитель - Д.В. Ребриков*

 

Работа выполнена в ЗАО «НФП ДНК-технология»

 

 

 

 

 

 

 

Московская гимназия на Юго-западе N 1543, 117571, Москва, ул. 26 Бакинских Комиссаров, д. 3, корп. 5. E-mail: Alnus_kolaensis@yahoo.co.uk, тел/факс: (+7910) 422-0657

 

* ЗАО «НПФ ДНК-Технология» 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24-2.

 

Москва  2005

Содержание

 

Аннотация                                                                                3

Введение                                                                                    3

Материалы и методы                                                             7

Результаты                                                                                10

Выводы                                                                                    17

Благодарности                                                                         17

Список литературы                                                                18

Приложение (список образцов)                                          19

 

Аннотация

На основе метода полимеразой цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией результатов создана ПЦР-тест-система для быстрого различения трех видов ольхи (Alnus Mill., Betulaceae) Европейской части России: Alnus incana (L.) Moench., Alnus glutinosa (L.) Gaertn. и Alnus kolaёnsis Orlova. На базе оборудования, выпускаемого ЗАО «НПФ ДНК-Технология», разработана переносная автономная ПЦР-лаборатория, позволяющая производить до 300 ПЦР-исследований в полевых условиях силами одного исследователя.

Ключевые термины: Betulaceae, Alnus, полиморфизм одиночных нуклеотидов (ПОН), полимеразная цепная реакция (ПЦР), FLASH, гибридизация в процессе амплификации.

 

Введение

Род Alnus Mill. включает 30−40 видов, распространенных в умеренных широтах Северного полушария (Комаров, 1936; Давидов, 1972; Furlow, 1979; Цвелев, 2004). Некоторые виды встречаются также в Южной Америке и Азии (где их ареал доходит до Бенгалии и Северного Вьетнама). В северном направлении отдельные виды доходят до лесотундры и тундры, а в горах поднимаются до субальпийского пояса.

Alnus incanaсамый распространенный в Евразии вид ольхи. Повсеместное распространение вида объясняет его широкий фенотипический полиморфизм. Существуют формы A. incana, которые некоторые исследователи считают отдельными видами (например, Alnus kolaёnsis Orlova (Орлова, 1954), произрастающая на юго-востоке Скандинавии, Кольском полуострове и Карельском берегу Белого моря, хотя по результатам морфометрического анализа этот таксон не отличим от A. incana (В.В.Ильинский, А.Б.Шипунов, in press)) и его таксономический статус до конца не определен.

Подобные формы свойственны и Aglutinosa. Одной из них, к примеру, является произрастающая на Кавказе ольха бородатая, таксономический статус которой колеблется от подвида (Alnus glutinosa var. barbata) до вида (A. barbata C.A.Mey.) (Черепанов, 1995).

Среди всего разнообразия подвидов A. incana и Aglutinosa встречаются формы, которые трудно отнести к тому или другому виду. В связи с возникающими проблемами при фенотипическом определении видовой принадлежности некоторых образцов, было решено разработать экспресс-метод определения видовой принадлежности по генетическим маркерам. Генетические методы довольно часто используют для решения подобных задач (например King, Ferris, 1998).

Большинство технологий генотипирования базируются на методе полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР – это метод амплификации определенного участка ДНК in vitro, причем в течение нескольких часов можно размножить определенную последовательность ДНК до количества, превышающего исходное в 1012 раз. ПЦР часто используют для высокоэффективного клонирования геномных последовательностей, сиквенирования ДНК, анализа вариаций нуклеотидных последовательностей и выявления патогенов (Дейвис, Иванов, 1990, Soltis et. al.. 1998, Demesure et. al., 1995).

В ходе анализа присутствующих в базах данных нуклеотидных последовательностей видов A.incana и A. glutinosa мы установили, что единственными известными на сегодняшний день видоспецифичными различиями на уровне ДНК являются различия отдельных нуклеотидов. Подобные различия, если они свойственны индивидуумам одного вида, называют полиморфизмом одиночных нуклеотидов (ПОН).

Для генотипирования определенных ПОН можно использовать принцип аллель-специфичной ПЦР. Данный подход основан на разной эффективности амплификации ДНК, различающихся по последовательности генов (Lay M.J. Wittwer C.T, 1997). Поэтому при разработке ПЦР-системы для дифференциации видов на основе единичных отличающихся нуклеотидов мы использовали принцип аллель-специфичной ПЦР.

Поскольку изначально мы планировали использовать разрабатываемую ПЦР-тест-систему в переносной ПЦР-лаборатории, а стандартная методика регистрации результатов ПЦР – электрофорез в агарозном геле – плохо подходит для применения в походных условиях, было решено использовать модификацию FLASH (Fluorescent Amplification based Specific Hybridization – специфическая флуоресцентная гибридизация в процессе амплификации), позволяющую детектировать результаты путем измерения флуоресценции в реакционной пробирке.

Ключевым элементом метода FLASH является использование гибридизационных олигонуклеотидных проб, меченных молекулами флуорофора и «темнового» гасителя. Для достижения максимальной эффективности гашения фоновой флуоресценции пробы, используемые в тест-системах FLASH, имеют структуру «шпилек», а флуорофор и гаситель присоединяют к концевым нуклеотидам (рисунок 1).

Рис 1. Шпилечная структура проб типа "молекулярный маячок"

 

Такие пробы в литературе часто называют «молекулярными маячками» (molecular beacons). Пробы добавляют в реакционную смесь наряду с праймерами и остальными компонентами реакции. Поскольку при образовании «шпильки» в структуре пробы флуорофор и гаситель оказываются в непосредственной близости друг от друга, то перед началом реакции флуоресценция отсутствует. Во время реакции пробы гибридизуются на образующиеся амплифицируемые фрагменты ДНК (рисунок 2), а на стадии синтеза комплементарной цепи Taq-полимераза разрушает пробу благодаря 5'-экзонуклеазной активности (рисунок 3). Это ведет к разделению флуорофора и гасителя и возрастанию уровня флуоресценции. Количество разрушенных проб и, соответственно, уровень флуоресценции пропорциональны количеству образовавшихся специфичных продуктов ПЦР. В предлагаемом варианте метода регистрация флуоресценции происходит после окончания реакции. Важно, что результаты ПЦР метода FLASH регистрируют по наличию флуоресценции в закрытых реакционных пробирках. Таким образом, необходимость в проведении электрофореза отпадает.

 

    Рис 2. Гибридизация пробы на ампликон.

    Рис 3. Разрушение пробы полимеразой.

 

 

 

 

Наши задачи включали:

 

(1) – Анализ известных последовательностей ДНК представителей рода Alnus с целью выявления видоспецифичных различий;

(2) – подтверждение видоспецифичности данных различий;

(3) – создание ПЦР-тест-системы, позволяющей различать два вида ольхи;

(4) – создание переносной ПЦР-лаборатории и

(5) проверка работоспособности лаборатории и ПЦР-системы в полевых условиях.

 

Материалы и методы

Методика выделения ДНК

ДНК выделяли из почек, гербарного материала или из листьев. При этом использовалась специально разработанная нами методика, основанная на комбинации стандартной методики с использованием бромистого цетилтриметиламмония (ЦТАБ) (пункты 1-7 методики) и сорбентной методики с использованием силикатных сорбентов и гуанидин тиоцианата (ГС) (пункты 8-21).

Необходимость создания собственной методики была вызвана тем, что применение только ЦТАБ не позволяло очистить образецы гербарного материала от примесей, существенно ингибирующих ПЦР, в то время как только методика ГС давала слишком низкий выход ДНК из-за низкой эффективности лизиса высушенных растительных тканей. Поэтому для эффективного лизиса мы использовали ЦТАБ, а затем "дочищали" образец на сорбенте.

Непосредственно перед выделением ДНК необходимо приготовить буфер для выделения. Для этого в буфере экстракции (0.35 M Sorbitol, 0.1 M Трис, 0.005 M ЭДТА (этилендиаминтетраацетат), 6 мл HCl) растворить бисульфит Nа (0.38г на 100 мл буфера для выделения). Затем 1 часть буфера экстракции (с бисульфитом Na) смешсть с 1 частью лизирующего буфера (0,2 M Трис pH 8.0, 0.05 M ЭДТА, 2 M NaCl, 2% CTAB) и 0.4 частями 5% N-Lauril-Sarcosine. Выделение ДНК проводить следующим образом:

Растереть образец ткани в ступке с 500 мкл буфера для выделения

Добавить 500 мкл 24:1 (хлороформ:изоамил) и тщательно встряхнуть (на вортексе)

Центрифугировать 10 мин при 10 000-14 000 rpm

Супернатант перенести в новые пробирки, добавить 750 мкл изопропанола и аккуратно встряхнуть руками.

Центрифугировать 10 мин при 10000-14000 rpm. Вылить супернатант.

Растворить в 100 мкл ТЕ(10 мМ Трис-HCl, 1 мМ Na2ЭДТА, рН 7,5).

Термостатировать пробирку в течение 15мин при 65°С, периодически встряхивая пробирку, до полного растворения осадка.

Добавить 150 мкл лизирующего раствора (6 М GuSCN, 50 мМ Трис-HCl pH 6,4, 20 мМ ЭДТА, 1,3% Triton X-100) и 20 мкл предварительно ресуспендированного сорбента (50% суспензия диатомовой земли в 1´ТЕ pH 8,6) в каждую пробирку с образцом и встряхните пробирку на вортексе в течение 3-5 сек.

Термостатировать пробирку в течение 10 мин при 65°С, периодически встряхивая.

Центрифугировать пробирку в течение 1 мин при 14000 об/мин.

Удалить надосадочную жидкость.

Добавить к осадку 200 мкл промывочного раствора №1 (6М GuSCN, 50 mM Трис-HCl pH 6,4, 2 mM ЭДТА) и встряхнуть пробирку на вортексе в течение 3-5 сек.

Центрифугировать пробирку в течение 1 мин при 14000 об/мин.

Удалить надосадочную жидкость.

Добавить к осадку 200 мкл промывочного раствора №2 (80% этанол) и встряхнуть пробирку на вортексе в течение 3-5 сек.

Центрифугировать пробирку в течение 1 мин при 14000 об/мин.

Удалить надосадочную жидкость.

Открыть крышку пробирки и термостатировать пробирку в течении 5 мин при 65°С.

Добавить к осадку 100 мкл элюирующего раствора (ТЕ рН 8,6) и встряхнуть пробирку на вортексе в течение 5-10 сек.

Термостатировать пробирку в течение 5 мин при 65°С.

Центрифугировать пробирку в течение 1 мин при 14000 об/мин. Перенести надосадочную жидкость в новую пробирку.

 

Методика проведения ПЦР

Амплификация производилась на детектирующих амплификаторах BIO-RAD iCycler iQ (BIO-RAD, США) и ДТ-322 (ДНК-Технология, Россия). Для проявки результатов реакции использовали как интеркалирующие красители (SYBRgreen I), так и специально синтезированную пробу (таблица 2).

Для обеспечения лучших начальных условий реакции использовали так называемый "горячий старт" – подход, при котором активный фермент не встречается с праймерами и ДНК при низких температурах (ниже 50-60 градусов). В нашем случае был использован вариант "горячего старта" с физическим разделением реакционной смеси с помощью парафиновой пробки. Нижняя смесь (под парафином) состояла из 0,125 мкл прямого и 0,125 мкл обратного праймеров, 0,07 мкл зонда, 18,0 мкл ПЦР буфера, 0,24 мкл дНТФ (дезоксирибонуклеозидтрифосфаты) и 1,44 мкл бидистиллированной воды. Верхняя смесь (над парафином) состояла из 5,0 мкл образца ДНК, 10,0 мкл ПЦР буфера и 0,5 мкл Taq- полимеразы (сокращение от названия бактерии, из которой выделяется – Thermus aquatiqus). Для предотвращения испарения с поверхности смеси, в пробирки добавлялось 20,0 мкл масла, которое образовывало пленку на поверхности. ПЦР буфер содержал 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl, pH 8,4, 2,5 мМ MgCl2 и 100 мкг/мл желатины (Дейвис, Иванов).

После приготовления смеси пробирки помещались в прибор. Запуск, снятие и обработка результатов производилась при помощи компьютерных программ, поставляемых с приборами. Пример получаемых на ДТ-322 данных представлен на рисунке 6. По оси абсцисс отложены циклы ПЦР, а по оси ординат – уровень флуоресценции в пробирках. Каждая кривая описывает изменение флуоресценции одного образца ДНК.

Для проведения ПЦР была подобрана оптимальная программа амплификации:

№№ п.п.            Температура    Время   Количество повторов

1.                              94°С                        1 мин                                      1

                                  94°С                      10 сек   

2.                              64°С *                    20 сек                                    50

                                  72°С                        10 сек   

3. 10°С                        Хранение                            -

 

* - регистрация результатов

Методика проведения ПЦР при помощи переносной ПЦР-лаборатории

Состав смеси не отличался от такового при проведении ПЦР на детектирующих амплификаторах (при этом использовали пробы для проявки результатов). Использование ПЦР-детектора «Джин» требует дополнительно наличия так называемых "фоновых" пробирок (служащих для вычитания фоновой флуоресценции). Поэтому дополнительно готовили 2 пробирки, в которых образцы ДНК были заменены на 5,0 мкл бидистиллированной воды.

Температурный режим был несколько изменен с целью сокращения времени программы:

№№ п.п.            Температура    Время   Количество повторов

1.                              94°С                        1 мин                     1

                                  94°С                        5 сек      

2.                              64°С                      5 сек                      50

                                  72°С                      5 сек      

3.            10°С                      Хранение           -

 

Методика анализа и интерпретации результатов при помощи переносной ПЦР-лаборатории

Для регистрации результатов ПЦР использовался флуоресцентный ПЦР-детектор «Джин». Прибор позволяет регистрировать результаты ПЦР без проведения электрофореза (не открывая пробирки). «Джин» подключается к компьютеру и использует программное обеспечение "Gene", которое позволяет в короткие сроки получить информацию о наличии или отсутствии продукта ПЦР в пробирке после амплификации.

Для проведения измерения в прибор последовательно загружают серии по 12 пробирок. После этого запускалась программа Gene, с помощью которой контролировалось измерение свечения в пробирках и производилась обработка результатов (Рис 4).

 

Рис 4. Пример результатов измерения с помощью ПЦР-детектора «Джин»

 

Результаты

Принцип работы ПЦР-тест-системы

Для выявления видоспецифичных участков ДНК мы проанализировали последовательности ДНК, представленные в наиболее полной базе данных nr Национального центра биотехнологической информации (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). По состоянию на март 2005 года база данных содержала всего всего 14 фрагментов ДНК (общей протяженностью 15499 нуклеотидов) для Alnus incana и 34 фрагмента ДНК (общей протяженностью 32073 нуклеотида) для Alnus glutinosa. Для Alnus kolaёnsis и A. barbata известных последовательностей в базе данных не содержалось. Общими для Alnus incana и Alnus glutinosa оказались лишь последовательности рибосомальных РНК и одной транспортной РНК. При сравнении общих последовательностей, наиболее привлекательным оказался внутренний транскрибируемый спейсер района рибосомальной РНК (ITS1), содержащий 2 видоспецифичные однонуклеотидные замены не небольшом расстоянии (другие последовательности содержали лишь отдельно расположенные однонуклеотидные замены (Рис 5). Различий в виде делеций или вставок протяженных районов выявлено не было.

 

Рис 5. Выравнивание последовательностей фрагмента региона ITS1 видов семейства Betulaceae. Номера в левой части выравнивания соответствуют видам следующим образом: 2 – Betula pendula Roth; 10 – A. cordata (Loisel.) Desf.; 14 – A. glutinosa (L.) Gaertn.; 15 – A. hirsuta Turcz; 20 – A. incana (L.) Moench.; 21 – A. rugosa (Du Roi) Sprengel; 22 – A. terunifolia (Nuttan); 23 – A. maritima Muhl. Ex. Nutt. Стрелки указывают позиции, отличающиеся у A. incana и A. glutinosa.

 

С целью сравнения региона ITS1 у различных представителей семейства Betulaceae мы проанализировали данный участок для 8 видов. В результате сравнения были выявлены консервативные участки, по последовательности которых были выбраны и синтезированы универсальные праймеры (Aln-d и Aln-r, таблица 2), позволяющие амплифицировать фрагмент длиной 256 пар нуклеотидов региона ITS1 большинства представителей Betulaceae и которые были использованы нами для положительного контроля (К+).

Поскольку современные базы данных нуклеотидных последовательностей часто содержат неточную информацию, с целью подтверждения истинности обнаруженных однонуклеотидных различий, мы определили последовательность фрагмента ITS1 для A. glutinosa и A. incana., а в дополнение, и для A. kolaёnsis и A. barbata. С этой целью нами была проведена ПЦР с универсальными праймерами с использованием образцов ДНК гербарного материала указанных видов. В исследование брали по три независимых гербарных образца каждого вида. Последовательность каждого продукта ПЦР (длиной 256 пар нуклеотидов) была определена, в результате чего было установлено, что указанные в базе данных различия присутствуют и в использованных нами гербарных образцах. Кроме того, было обнаружено, что генотип A. barbata на амплифицированном участке ITS1 не имеет отличий от A. glutinosa, а генотип A. kolaёnsis по одной из позиций соответствует A. glutinosa, а по другой A. incana (таблица 1).

Таким образом, впервые было установлено, что A. kolaёnsis отличается по последовательности ITS1 от других видов Alnus, что можно считать дополнительным аргументом в пользу выделения A. kolaёnsis в отдельный вид. Определение последовательности также показало, что различение A. glutinosa и A. barbata с помощью ПЦР-системы, основанной на выбранных различиях невозможно.

 

Таблица 1. Выявленные в результате определения последовательностей генотипы. Позиция нуклеотида соответствует его порядковому номеру в сделанном выравнивании (рисунок 5)

Позиция нуклеотида/Вид              132           177

 

Alnus incana                                            A              T

Alnus glutinosa                                        G              C

Alnus kolaensis                                        G              T

Alnus barbata                                          G              C

 

Дизайн ПЦР-тест-системы

На основании последовательности региона ITS1 были выбраны праймеры, содержащие в своем составе (в 3'-концевой позиции) обозначенные различия, а также проба для флуоресцентной детекции результатов (таблица 2).

 

Таблица 2. Последовательности использованных в работе праймеров и проб.

 

Название праймера/пробы         Последовательность

Aln-d                                                      5'-GAACCTGCGGAAGGATCATTGTC-3'

Aln-r                                                       5'-CGTTGCCGAGAGTCGTTATGGT-3'

Ag-d1                                                     5'-GCCCTCGAACGGCAGGG-3'

Ag-r1                                                      5'-GTTCATGTTCCTTGGCGCG-3'

Ai-d1                                             5'-GCCCTCGAACGGCAGGA-3'

Ai-r1                                             5'-GTTCATGTTCCTTGGCGCA-3'

Aln-pb1                                                  (BHQ1)-5'-CGTGCCGAACAACGTACCCCGGCGCG-3'-(FAM)

 

Различение генотипов основано на том факте, что используемая для проведения ПЦР ДНК-полимераза "не любит" удлинять праймер с не комплементарным матрице 3'-концевым нуклеотидом. Таким образом, на основании того, какая пара праймеров раньше всех образует продукт ПЦР, можно сделать вывод о видовой принадлежности исследуемого образца.

Для определения видовой принадлежности образца, необходимо провести ПЦР с праймерами Ag-d1, Ag-r1, Ai-d1 и Ai-r1 в четырех комбинациях, а также, с парой универсальных праймеров в качестве положительного контроля (таблица 3). Комбинация праймеров Ai-d1 + Ag-r1 не имеет подходящей цели среди проанализированных последовательностей видов Betulaceae, поэтому мы использовали ее в качестве отрицательного контроля.

 

Таблица 3. Комбинации праймеров и выявляемые виды.

 

Комбинация праймеров             выявляемый генотип     Выявляемый вид

Ag-d1 + Ag-r1                                                      G+C       Alnus glutinosa или Alnus barbata

Ag-d1 + Ai-r1                                                       G+T       Alnus kolaensis

Ai-d1 + Ag-r1                                                       A+C       в природе не встречается (отрицательный контроль)

Ai-d1 + Ai-r1                                                        A+T       Alnus incana

Aln-d + Aln-r                                                        Betulacea            все виды Betulaceae

                         

Таким образом, подобранные пары праймеров позволяют дифференцировать не только A.incana и A.glutinosa (как планировали изначально), но и оказавшийся отличающимся по последовательности ДНК ITS1 подвид A.kolaensis.

Всего (в лабораторных и полевых условиях) с помощью разработанной ПЦР-тест-системы было исследовано 29 гербарных и 11 природных образцов, из них 5 образцов A.barbata, 9 – A.kolaensis, 10 – A.incana, 7 – A.glutinosa, 9 – A. pubescens (принадлежность образцов к видам, неразличимым с помощью разработанной ПЦР-тест-системы проводилось по морфологическим признакам или было известно заранее).

Отработка системы с использованием детектирующих амплификаторов (Real-Time PCR)

Несмотря на то, что используемая для проведения ПЦР Taq-полимераза плохо удлиняет  праймеры с неспаренным 3'-концевым нуклеотидом, она способна в небольшом проценте случаев удлинять такой праймер. После такого события праймер перестает быть "видоспецифичным" и эффективно участвует в ПЦР. В связи с этим, при большом числе циклов амплификации, продукт образуется со всех пар праймеров независимо от генотипа исследуемого образца. Причем по окончании реакции количество ДНК во всех пробирках будет примерно равно. Поэтому, для выбора наилучшего числа циклов амплификации (когда количество ампликонов, синтезированных с участием комплементарных праймеров, во много раз больше количества ампликонов, синтезированных с участием некомплементарных праймеров) было решено сначала отработать систему ПЦР на детектирующем амплификаторе, который позволяет установить эффективность амплификации для каждой пары праймеров независимо от конечного числа циклов реакции. Прибор строит кривые накопления количества ДНК в пробирке в ходе реакции. Чем раньше начинается рост кривой, тем, в нашем случае, эффективнее работает данная пара праймеров (пример см. на рисунке 6).

Рис 6. Пример графиков накопления ДНК, полученных с использованием детектирующего амплификатора.

Разработка переносной ПЦР-лаборатории

Для проведения ПЦР в походных условиях использование детектирующих амплификаторов не удобно в связи с большой массой прибора (более 15 кг), высоким энергопотреблением и "хрупкостью" за счет наличия сложной оптической схемы.

ЗАО "НПФ ДНК-Технология" выпускает уникальный прибор – ПЦР-детектор – позволяющий регистрировать уровень флуоресценции в закрытой реакционной пробирке по окончании амплификации. Таким образом, можно проводить реакцию на обычном (более компактном, экономичном и устойчивом к транспортировке) ампплификаторе, а измерение проводить с помощью компактного ПЦР-детектора.

Мы укомплектовали мобильную лабораторию амлификатором «Терцик» (ДНК-технология), детектором «Джин» (ДНК-технология), термостатом «Термит» (ДНК-технология), миницентрифугой/вортексом Micro-Spin FV-2400 (Biosan), центрифугой МiniSpin (Eppendorf), набором полуавтоматических пипеток (HTL), ноутбуком (Panasonic), аккумулятор и преобразователь напряжения (MobilEn). Лаборатория указанного состава помещается в обыкновенный чемодан (за исключением аккумулятора) и с легкостью перемещается одним человеком (см. рисунки 7 и 8).

 

Рис 7. Исследователь с мобильной ПЦР-лабораторией.

 

 

Рис 8. Комплектация  мобильной ПЦР-лаборатории.

 

Разработанная ПЦР-лаборатория была опробована в полевых условиях в г. Москве (на Воробьевых горах). ПЦР-лаборатория может быть использована в любых ситуациях, когда возникает необходимость провести ПЦР-анализ. Так, использование подобной лаборатории может быть эффективным в службах МВД для идентификации практически любых биологических фрагментов, в МЧС и СЭС для выявления широкого круга инфекционных агентов, в пищевой промышленности для выявления в составе продуктов питания генномодифицированных компонентов.

ПЦР-лаборатория в подобранным типом аккумулятора может быть использована для проведения в полевых условиях полного исследования (выделение ДНК, амплификация и детекция результатов) до 300 образцов.

 

 

ВЫВОДЫ.

1. Разработана методика выделения хорошо подходящей для ПЦР ДНК из гербарного материала.

2. Впервые определена последовательность участка ITS1 видов A. kolaensis и A. barbata. Установлено достоверное отличие ITS1 A. kolaensis от других видов рода Alnus.

3. Установлены видоспецифичные позиции в ДНК, отличающие A. glutinosa, A. incana и A. kolaensis.

4. Разработана ПЦР-тест-система, с помощью которой можно различить 3 вида ольхи.

5. Для проведения исследований в полевых условиях создана и испытана переносная ПЦР-лаборатория.

 

 

 

Благодарности

 

Автор выражает благодарность коллективу «НПФ ДНК-технология» за помощь в работе. Автор признателен сотрудникам гербария МГУ (MW) и БИН РАН (LE) за содействие в сборе материала, а также Шипунову А.Б. за ценные замечания и советы.

Список литературы

Demensure B., Sodzi N., Petit R.J. (1995) A set of universal universal primers for amplification of polymorphic non-coding regions of mitochondrial and chloroplast DNA in plants – Molecular Ecology, 4, p. 129-131

Flash. Система флуорисцентной детекции результатов ПЦР – М.: ДНК-технология.

Furlow J. J. (1979) The systematic of American species of Alnus (Betulaceae) – Rhodora. Vol. 81. N. 825. р. 1−69.

King R.A., Ferris C. (1998) Chloroplast DNA phylogeography of Alnus glutinosa (L.) Gaertn. – Molecular Ecology 7, p. 1151-1161

Lay M.J. Wittwer C.T. (1997) Real-time fluorescence genotyping of factor V Leiden during rapid-cycle PCR//Clin Chem. Dec;43(12):2262-7.

Navarro E., Bousquet J., Moiroud A., Munive A., Piou D., Normand P. (2003) Molecular phylogeny of Alnus (Betulaceae), ifferred from nuclear ribosomal DNA ITS sequences – Plant and Soil, 254, p. 202-217

Petit R.J., Kremer A., Wagner D.B. (1993) Geographic structure of chloroplast DNA polymophisms in European oaks – Theoretical and Applied Genetics, 87, p.122-128

Saiki R.K., Gullensten U.B., Erlich H.A. (1992) Полимеразная цепная реакция // Анализ генома. Методы. – М.: Мир, С. 177-190

Soltis D.E., Soltis D.S., Doyle J.J (1998) Contributions of PCR-Based methods of plant systematics and evolutionary biology // Molecular systematics of plant II. DNA Sequensing – Massachusetts: Kluwer Academic Publisher

Давидов М. В. (1972) Лесоводственно-биологическая характеристика ольхи // М., С. 4−13.

Комаров В. Л. (1936) Род Ольха – Alnus Gaertn. // Флора СССР. М.;Л., С. 306−319.

Орлова Н. И. (1954) Новый вид ольхи с Кольского полуострова // Бот. мат. Герб. БИН., Т. 16. С. 70−75.

Цвелев Н.Н. (2002) О родах Betula L. и Alnus Mill. (Betulaceae) в Восточной Европе. – Новости систематики высших растений. Т. 34. Спб., C. 47–70.

Цвелев Н.Н. (2004) Ольха — Alnus Mill. // Флора Восточной Европы. Т. 11. Спб., С. 87–90.

Черепанов С. К. (1955) Система рода Alnus Mill. s. str. и близких к нему родов // Бот. мат. герб. БИН. М.;Л., Т. 17. С. 91−105.

 

Приложение.

Перечень образцов, исследованных с помощью ПЦР-тест-системы в ходе данной работы

 

Alnus barbata

Ворожбеев, 8.03.2005

Поселок Краснодарский край, пос. Волхонка, у остановки

 

Alnus barbata

Ворожбеев, 8.03.2005

Поселок Краснодарский край, пос. Волхонка, у остановки

 

Alnus barbata

Ворожбеев, 8.03.2005

Поселок Краснодарский край, пос. Волхонка, у остановки

 

Alnus glutinosa

Назаровъ М.И., 12.07.1914г.

Владимирсая область, Покровский р-н, Крестов брод, на вырубке болтистого леса.

 

Alnus glutinosa

Соколова В., 12.07.1958г.

Рязанский р-н, Радьковская дача, кв 72

 

Alnus glutinosa

Тихомиров, Мижевикиная, 2.07.1967 г.

Рязанская область,  Спасский р-н, близ р. Лакаш, черноольшанник близ ручья

 

Alnus glutinosa

Серегин, Привалова, 4.08.2002 г.

Владимирская область, Меленковский р-н, 2 км к В от пос. Добрятино вдоль магистральной ж/д. Лесной овражек в ельнике.

 

Alnus incana

Власов, 14.06.1964 г.

Луг в прирусловой пойме реки Протвы Можайского р-на Московской области.

 

Alnus incana

Сукачев, 24.04.1949 г.

Московская область, Звенигородский р-н, окрестности пос. Мозжинка, вдоль ручья среди дач.

 

Alnus incana

Сырейщиков, 13.08.1922 г.

Московская область, Клинский уезд, опушка леса у Онежского озера.

 

Alnus incana

Каден М.Н., 23.04.1939 г.

Солнечногорский р-н, парк совхоза Болдино у Муравьевского пруда.

 

Alnus kolaensis

Орлова, 08.1953 г.

Типовой образец

 

Alnus kolaensis

Зайцева, Пеков, 15.07.1961 г.

Мурманская область, Кировский р-н, Хибинския ГС МГУ, Ю склон г. Юкспор, h=480м, ельник-черничник

 

Alnus kolaensis

Чернышева, 26.06.1954 г.

Хибины, Ю залив Най-Кунявра

 

Alnus kolaensis

Полозова, Денисова, 1954 г.

Хибины

 

Alnus barbata

Покаржевский, 17.07.1967 г.

Ставропольский край, Карачаево-черкесская АО, долина р. Кубань, дорога к аулу 44 Кулан

 

Alnus barbata

Рахимбердиев, Соколов, Стогов, 26.03.1996

Краснодарский край, Сочинский р-н, окрестности Хосты, Кавказский заповедник, участок Тисо-Самшитовая Роща, левый берег р. Хосты, по краю галечника у реки

 

Alnus x pubescens

Ильнский, 24.08.1913

Берег пруда Дымовка

 

Alnus kolaensis

Орлова, Чернов, Дряхлова, 02.08.1956

Правый берег р. Гирвас, в 18 км от истоков. Долинный травяно-елово-березовый лес по берегу.

 

Alnus incana var. borealis (= Alnus kolaensis)

06.08.1913

Р. Варзуга, село Варзуга, на берегу речки

 

Alnus kolaensis

Орлова, Понаморева, 02.01.1955

Левый берег реки Печенги, в 5 км от Луасшари, у воды

 

Alnus kolaensis

Орлова, Чернов, Квеженин, 05.09.1958

В 15 км к Ю от озера Глубокого, травянистые березняки

 

Alnus incana x Alnus glutinosa (= Alnus hybrida)

09.07.1902

Livland, Rige, im den Diren bei Bullenkof

 

A. glutinosa x incana

Сангей, 08.1898

Nylandia, par. Sibbo, skraddarby

 

Alnus pubescens

Смирнов, 14.08.1923

Веретневская лесная дача на берегу Волги, против с. Никулино

 

Alnus glutinosa x Alnus incana

Цинзерлинг, 07.08.1922

Павловск. Парк, Сырая опушка елового леса, вместе с Alnus incana

 

Alnus x pubescens

08.08.1916

Волоодская губа, Каргопольскй уезд, между дер. Форсново и Федово на песчаной осыпи берега р. Мочешь

 

Alnus pubescens

 

Alnus pubescens

Шепников, Лесков, 08.07.1926

Вологодская губа, Вельский уезд, окр. г. Пельсча, притеррасное болото на старом аллювии у д. Филяево

 

Alnus incana

Булавкина, 16.07.1912

Катаев-Ивановский завод

 

Alnus kolaensis

05.08.1953

Типовой образец

 

Alnus glutinosa x incana

19.08.1920

Ольшанник по берегу р. Онеусская между с. Вознесенье и Куликовым маяком

 

Alnus incana

Ильинский, 08.06.2005

Москва, 500 м к В по правому берегу от ст. метро «Воробьевы горы», в 100 м от берега

 

Alnus glutinosa

Ильинский, 08.06.2005

Москва, 500 м к В по правому берегу от ст. метро «Воробьевы горы», в 100 м от берега

 

Alnus incana

Ильинский, 08.06.2005

Москва, 500 м к В по правому берегу от ст. метро «Воробьевы горы», в 100 м от берега

 

Alnus incana

Ильинский, 08.06.2005

Москва, 500 м к В по правому берегу от ст. метро «Воробьевы горы», в 100 м от берега

 

Alnus glutinosa

Ильинский, 08.06.2005

Москва, 500 м к В по правому берегу от ст. метро «Воробьевы горы», в 100 м от берега

 

Alnus incana

Ильинский, 08.06.2005

Москва, 500 м к В по правому берегу от ст. метро «Воробьевы горы», в 100 м от берега

 

Alnus glutinosa

Ильинский, 08.06.2005

Москва, 500 м к В по правому берегу от ст. метро «Воробьевы горы», в 100 м от берега

 

Alnus incana

Ильинский, 08.06.2005

Москва, 500 м к В по правому берегу от ст. метро «Воробьевы горы», в 100 м от берега